|
|
Preparation and expression of p53 protein isoforms using the GATEWAY expression system
Wikarská, Monika ; Hrstka, Miroslav (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
The TP53 gene can express protein p53 and 11 another isoform proteins N- and/or C-terminally truncated by using two promoters and alternative splicing. The p53 isoforms are found in both healthy and tumorous tissues, and are intensively studied in relation to cancer diagnosis, prognosis and treatment. In this work, the p53 isoforms were subcloned into expression vectors by LR reaction adapted from Gateway cloning system. The expression vectors were designed for protein production by bacteria E. coli strain BL-21. The constructs containing p53 isoforms were encoded together with two fusion proteins, glutathione-S-transferase and polyhistidine tag under the control of the same promotor for the affinity chromatography protein isolation. All the clones underwent Sanger sequencing for verification after homologous recombination. Sequencing confirmed the accuracy of the subcloned isoforms p53, 133p53, 160p53, p53 and 160p53 into an expression vector pDEST15-N6xHis-GST-GW-DEST. Protein 160p53 was expressed in BL-21 and isolated using both HIS and GST tag interacion. Isolation using HIS tag yielded in a higher protein concentration then the isolation mediated by the interaction of the glutathione-S-transferase.
|
|
|
Optimization of p53 mutant protein isolation and its DNA binding properties
Osadchuk, Olha ; Zemanová, Jana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
P53 protein is one of the most important molecules in the human body. It is responsible for several cellular processes such as DNA repair, cell cycle or induction of apoptosis. P53 is also known as “guardian of the genome”. DNA binding ability of p53 is important for the normal cell development and growth. Different mutation of TP53 gene, may cause lost of p53 binding ability andits tumor suppressor function that may lead to the cancer development. The theoretical part of this diploma thesis, is focused on the characterization of main properties, function and mechanism of p53 protein activation and description oflocal secondary DNA structures. The main goal of the experimental part was production of four mutant forms of p53 protein and wild-type p53 protein and studying its binding properties with different local secondary DNA structures. Using Gateway cloning system, four expression vectors were prepared and used for protein production in the bacterial expression system. In total, four mutant and one wild-type p53 protein were prepared and their DNA binding properties were evaluated by Electrophoretic Mobility-Shift Assay The results suggest different DNA-binding properties of wild-type p53 and mutant forms of this protein. All studied mutant proteins lost ability to bind DNA sequence specifically, whereas non- specific interaction with DNA were sustained for three out of four mutant forms. One of the studied mutant proteins showed preference for superhelical form of DNA.
|
|
|
Strukturní analýza interakčního rozhraní mezi protilátkou a proteinovým epitopem
Moravec, Jan ; Krejčíř, Radovan (oponent) ; Müller,, Petr (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá studiem myší monoklonální protilátky EEV1-2.1, která byla vytvořena v laboratořích RECAMO imunizací myši proteinem Hsp90 a následnou fúzí splenocytů s myší myelomovou linii. Teoretická část této práce se zaměřuje především na studium protilátek, zejména jejich struktury, genetiky a popis monoklonálních protilátek. V této části práce lze dále najít průřez moderními biotechnologickými trendy, které jsou v současné době používány k produkci protilátek. Dále jsou popsány CHO buňky a tetracyklinové inducibilní systémy. Cílem diplomové práce bylo charakterizovat zmíněnou protilátku. Pomocí bioinformatických metod a predikčních softwarů predikovat a popsat její strukturu, především potom analyzovat hypervariabilní CDR oblasti. Dalším cílem bylo pomocí metody Gateway klonovat lehký a těžký řetězec protilátky. Finálním krokem bylo vytvoření tetracyklinového inducibilního systému pro efektivní produkci samotné protilátky. Experimentální část práce se úvodem zabývá izolací RNA sekvence protilátky pomocí komerčních kitů. Dále je popsána metoda amplifikace dané sekvence pomocí PCR s reverzní transkripcí. Následuje popis metody Gateway klonování, která umožňuje pohodlné vložení vybraného genu do cílového vektoru. Objasněny jsou též základní bioinformatické metody použité ke studiu struktury protilátek a také predikce komplexnější 3D struktury protilátky včetně možných interakcí s proteinem HSP90. V této části lze najít popis metod transfekce ExpiCHO buněk a inducibilní produkce protilátky využívající tetracyklinový inducibilní systém. Diplomová práce vedla k úspěšnému naklonování lehkého a těžkého řetězce protilátky a následnému vložení expresního vektoru do produkčních ExpiCHO buněk. Expresní systém na bázi indukce přídavkem doxycyklinu byl poté úspěšně testován několika metodami a výsledky ukazují, že je inducibilní systém nejen funkční, ale může dokonce vést ke zvýšené produkci monoklonální protilátky oproti konvenčním metodám.
|
|
|
Diversity of Polycomb complexes and their function
ŘÍHA, Luboš
Cílem této práce je testování a další vývoj systému vektorů (plazmidů). Tento systém by měl přispět k vyjasnění domnělé překrývající se funkce podjednotek Polycomb represivního komplexu 2 (PRC2). V teoretické části je uvedena epigenetika jako vědní obor a je vysvětlena důležitost Arabidopsis thaliana (Huseníček rolní)ve výzkumu. Problematika překrývající se funkce podjednotek PRC2 SWINGER a CURLY LEAF je postavena do kontextu a je zformulována hlavní otázka projektu. Důležité prvky genetického inženýrstvíjsou vysvětleny. A nakonec je objasněna praktická část projektu, kde se vyvíjel systém vektorů s promotory a markery a proběhla selekce a genotypování transgenních rostlin. Výsledky byly prezentovány a diskutovány.
|
|
|
Optimization of p53 mutant protein isolation and its DNA binding properties
Osadchuk, Olha ; Zemanová, Jana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
P53 protein is one of the most important molecules in the human body. It is responsible for several cellular processes such as DNA repair, cell cycle or induction of apoptosis. P53 is also known as “guardian of the genome”. DNA binding ability of p53 is important for the normal cell development and growth. Different mutation of TP53 gene, may cause lost of p53 binding ability andits tumor suppressor function that may lead to the cancer development. The theoretical part of this diploma thesis, is focused on the characterization of main properties, function and mechanism of p53 protein activation and description oflocal secondary DNA structures. The main goal of the experimental part was production of four mutant forms of p53 protein and wild-type p53 protein and studying its binding properties with different local secondary DNA structures. Using Gateway cloning system, four expression vectors were prepared and used for protein production in the bacterial expression system. In total, four mutant and one wild-type p53 protein were prepared and their DNA binding properties were evaluated by Electrophoretic Mobility-Shift Assay The results suggest different DNA-binding properties of wild-type p53 and mutant forms of this protein. All studied mutant proteins lost ability to bind DNA sequence specifically, whereas non- specific interaction with DNA were sustained for three out of four mutant forms. One of the studied mutant proteins showed preference for superhelical form of DNA.
|
|
|
Preparation and expression of p53 protein isoforms using the GATEWAY expression system
Wikarská, Monika ; Hrstka, Miroslav (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
The TP53 gene can express protein p53 and 11 another isoform proteins N- and/or C-terminally truncated by using two promoters and alternative splicing. The p53 isoforms are found in both healthy and tumorous tissues, and are intensively studied in relation to cancer diagnosis, prognosis and treatment. In this work, the p53 isoforms were subcloned into expression vectors by LR reaction adapted from Gateway cloning system. The expression vectors were designed for protein production by bacteria E. coli strain BL-21. The constructs containing p53 isoforms were encoded together with two fusion proteins, glutathione-S-transferase and polyhistidine tag under the control of the same promotor for the affinity chromatography protein isolation. All the clones underwent Sanger sequencing for verification after homologous recombination. Sequencing confirmed the accuracy of the subcloned isoforms p53, 133p53, 160p53, p53 and 160p53 into an expression vector pDEST15-N6xHis-GST-GW-DEST. Protein 160p53 was expressed in BL-21 and isolated using both HIS and GST tag interacion. Isolation using HIS tag yielded in a higher protein concentration then the isolation mediated by the interaction of the glutathione-S-transferase.
|
host ::
RSS.